Zeit der Handlung: Juni 1800


Erster Akt
In der Kirche Sant› Andrea della Valle. Es ist Mittag, und die Kirche ist leer.
Angelotti hat dort Zuflucht gesucht und lässt sich mit einem Schlüssel, den seine Schwester für ihn versteckt hat, in die Familienkapelle ein, wo er als Fluchthilfe Frauenkleidung für sich findet.
Der Maler Cavaradossi kehrt zurück, um ein Gemälde der Maria Magdalena fortzusetzen. Der Mesner, dem der Freidenker Cavaradossi ohnehin verdächtig ist, erkennt mit Entrüstung, dass der Maler eine Frau, die kürzlich alleine zum Beten in die Kirche gekommen ist (keine andere als Angelottis Schwester) heimlich zum Modell für das Bildnis genommen hat. Cavaradossi vergleicht das Bild mit dem Miniaturporträt seiner Geliebten, der Sängerin Floria Tosca, das er immer bei sich trägt.
Nach dem Abgang des Mesners kommt Angelotti aus der Kapelle. Cavaradossi und er erkennen sich gegenseitig, werden aber von der Sängerin Floria Tosca, Cavaradossis Geliebter, gestört. Angelotti versteckt sich abermals.
Die grundlos eifersüchtige Tosca beschuldigt ihren Liebhaber der Untreue, doch Cavaradossi beruhigt sie, und die beiden verabreden sich für den Abend in der Villa des Malers. Das Gemälde Maria Magdalenas erregt erneut Toscas Misstrauen, aber Cavaradossi beschwichtigt sie und schickt sie fort.
Er bietet Angelotti seine Villa an und beschreibt ihm ein Versteck, das sich im Brunnen des Gartens befindet. Ein Kanonenschuss verkündet, dass die Flucht entdeckt worden ist, und Cavaradossi beschliesst spontan, Angelotti selber zur Villa zu führen.
Der Mesner kehrt mit der Nachricht von der angeblichen Niederlage Napoleons bei Marengo zurück, und während die Chorsänger eintreffen, kündigt er an, dass man den Sieg feiern wird: Floria Tosca wird im Palazzo Farnese eine Kantate singen, und in der Kirche soll ein Tedeum stattfinden.
Scarpia, der von Angelottis Flucht erfahren hat, betritt die Kirche. Beim Verhör des Mesners stellt sich für ihn eine Verbindung zwischen Angelotti, dem Maler und dem Porträt von Angelottis Schwester her; in der offenen Kapelle findet er einen Fächer, der dem Bündel Frauenkleidung entfallen ist.
Tosca kehrt zurück, um Cavaradossi zu erklären, dass sie bei der Siegesfeier in einer Kantate singen muss und ihre Verabredung nicht einhalten kann. Seine Abwesenheit erregt abermals ihre Eifersucht, und Scarpia nutzt den Fächer, um ihren Argwohn noch zu schüren. Als sie sich aufmacht, um Cavaradossi und seine vermeintliche Geliebte in der Villa zu suchen, schickt ihr Scarpia drei seiner Agenten nach. Während das Tedeum beginnt, sinnt Scarpia über sein Vorhaben, Tosca zu gewinnen und ihren Liebhaber hinzurichten.

Zweiter Akt
Am selben Abend in Scarpias Zimmer im oberen Stockwerk des Palazzo Farnese. Allein bei seinem Abendessen, ist Scarpia noch immer mit seinem Plan für Tosca und Cavaradossi beschäftigt. Er weist einen seiner Agenten an, Tosca bei ihrer Ankunft eine Nachricht zu übergeben.
Ein zweiter Agent, Spoletta, kehrt von Cavaradossis Villa zurück, wo er keine Spur von Angelotti entdeckt hat, besänftigt Scarpia jedoch mit der Mitteilung, Cavaradossi selbst sei verhaftet. Scarpia nimmt den hereingeführten Künstler ins Verhör, aber dieser bestreitet jegliches Wissen von Angelottis Flucht oder Verbleib. Tosca tritt nach dem Ende der Kantate ein; Scarpia schickt Cavaradossi zum weiteren Verhör in einen anderen Raum und wendet sich nun Tosca zu. Auch sie will von nichts wissen, bis Scarpia eröffnet, dass ihr Liebhaber gefoltert wird. Unter diesem Druck gibt Tosca schliesslich nach und enthüllt Angelottis Versteck.
Cavaradossi wird freigelassen und aus der Folterkammer geführt. Als er von Toscas Verrat hört, weist er sie von sich. Plötzlich bringt ein Agent die Nachricht, dass die ersten Siegesmeldungen verfrüht waren und die Franzosen die Schlacht von Marengo gewonnen haben. Cavaradossis begeisterte Reaktion provoziert Scarpia, ihn zum Tode zu verurteilen, und er wird abgeführt.
Scarpia nennt Tosca das einzige Mittel, mit dem sie Cavaradossi retten kann: Sie muss sich ihm hingeben. Toscas Flehen rührt ihn nicht, sondern steigert nur seine Begierde. Spoletta unterbricht mit der Nachricht, dass sich Angelotti bei seiner Entdeckung das Leben genommen hat; der Agent will wissen, was nun mit Cavaradossi geschehen soll. Scarpia überlässt Tosca die Entscheidung. Schweigend deutet sie ihr Einverständnis an, verlangt dann jedoch die sofortige Freilassung ihres Liebhabers. Damit man den Maler für tot hält, ordnet Scarpia seine Scheinhinrichtung an und beauftragt damit Spoletta, wobei er betont, genau wie schon bei einer früheren Gelegenheit vorzugehen. Tosca verlangt freies Geleit aus Rom für Cavaradossi und sich selbst. Während Scarpia den Schutzbrief ausstellt, erblickt Tosca auf dem Esstisch ein Messer. Als Scarpia sich erhebt, um sie zu umarmen, stösst sie ihm die Klinge ins Herz. Scarpia stirbt, und Tosca löst den Schutzbrief aus seiner verkrampften Hand. Sie stellt zwei Kerzen neben seinen Kopf, legt ihm ein Kruzifix von der Wand auf die Brust und stiehlt sich davon.

Dritter Akt
Schauplatz ist die Plattform der Engelsburg, wo Cavaradossi erschossen werden soll. Beim Aufgehen des Vorhangs herrscht noch Dunkelheit. Im ersten Morgengrauen hört man aus der Ferne das Lied eines Hirtenjungen; nahebei läuten Kirchenglocken zur Mette.
Cavaradossi wird herbeigeführt und einem Schliesser übergeben, den er besticht, einen Brief an Tosca weiterzuleiten. Verzweifelt nimmt er Abschied vom Leben.
 Plötzlich erscheint Tosca mit dem Schutzbrief, erzählt von der Ermordung Scarpias und erklärt die geplante Scheinhinrichtung mit Platzpatronen. Tief gerührt ergreift Cavaradossi Toscas Hand und beide begrüssen glücklich den heraufziehenden Tag ihrer Freiheit.
Ein Zug Soldaten rückt an und führt die Hinrichtung aus. Nach deren Abzug geht Tosca auf Cavaradossi zu, um ihm aufzuhelfen, aber er ist tot.
Scarpias Leichnam ist entdeckt worden; seine Agenten und die Soldaten eilen herzu, um Tosca festzunehmen, aber sie läuft zur Brüstung und stürzt sich in den Tod.