Erster Akt: Rom, im Wohnhaus des Komponisten Palestrina im Jahre 1653, kurz vor Abschluss des Trienter Konzils.
Im Arbeitszimmer Palestrinas spielt dessen Schüler Silla ein Stück auf der Geige, das er selber komponiert hat, und singt dazu. Er erklärt dem dazukommenden Ighino, dem jungen Sohn Palestrinas, wie sehr ihn ein neuer, in Florenz aufgekommener Musikstil begeistere. Während dessen treten Palestrina und der Kardinal Borromeo, der vom Trienter Konzil kommt, ins Zimmer. Borromeo kritisiert die neuen Töne Sillas und wundert sich, dass Palestrina da toleranter ist: "Das ist die neue Zeit, die in ihm gärt," beschwichtigt dieser die neuen künstlerischen Ideen Sillas und gibt zu bedenken, "ob jetzt die Welt nicht ungeahnte Wege geht, und was uns ewig schien, nicht wie im Wind verweht?" Borromeo, der nichts von den neumodischen, weltlichen Klängen hält und die profanen Texte und üppigen Liedmotive als Irrungen bezeichnet, möchte den reinen, altbewährten Musikstil des Gregorianischen Chores wieder beleben und bittet Palestrina, in diesem Sinne eine neue Messe zu schreiben.
Wenn denn ein solches Werk gelänge – dies hat der Papst mir zuerkannt – so sei gelöst des Fluches Strenge, die die gesamte Kunst noch bannt. Der neuen Messe Stil und Haltung sie sei fortan die feste Norm. So brächte dieses Werks Gestaltung der Tonkunst Richtung und Reform.
Palestrina lehnt das Ersuchen des Kardinals um eine neue Mustermesse ab, da er sich seit dem Tod seiner Frau am Ende seiner Schaffenskraft sehe. Borromeo kann ihn nicht umstimmen und verlässt den Kompo-nisten im Zorn. Dieser bleibt von Traurigkeit überwältigt alleine im Zimmer zurück. Plötzlich hat er eine Vision: Die großen Meister der Vergangenheit erscheinen ihm und fordern ihn auf, mit der Komposition der Messe sein Lebenswerk zu vollenden und zu krönen. Schließlich gipfelt die Szene im stummen Auf-tritt von Palestrinas verstorbener Frau Lucrezia und einem Chor von Engeln, die dem Komponisten ein neues Werk in die Feder diktieren. Nach vollbrachter Arbeit schläft Palestrina erschöpft ein. Am nächsten Morgen sammeln Silla und Ighino die auf dem Tisch und dem Boden verstreuten Notenblätter der im Laufe einer Nacht geschriebenen Messe auf.

Zweiter Akt: Trient, Halle im Palast des Fürstbischofs Madruscht
Im Palast des Fürstbischofs Madruscht zu Trient bereiten die Kardinäle Novagerio und Borromeo die nächste Sitzung des Konzils vor. Es geht um politisch opportune Zugeständnisse des Papstes an den deutschen Kaiser Ferdinand, der unter anderem die Rettung der Kirchenmusik wünscht. Borromeo berichtet von seinem Misserfolg bei Palestrina, Novagerio erklärt, die Komposition der Messe müsse notfalls mit der Anwendung von Gewalt gegenüber dem Musiker erzwungen werden. Nachdem Kardinal Morone feierlich die Konzilsitzung eröffnet hat, kommt es zu turbulenten Wortgefechten. Man kann sich weder über die Zukunft der Kirchenmusik, noch zur Sprache der Messe (ob Latein oder Landessprache) einigen. Persönliche Eitelkeiten, sinnlose Einwürfe, die Frage nach Diäten – alle möglichen grotesken und abstoßenden Begleiterscheinung einer solchen Versammlung treten deutlich zu Tage. Der Tumult wird immer größer, so dass die Sitzung schließlich unterbrochen werden muss. Abschließend geraten die Diener einiger Kirchenfürsten in handgreiflichen Streit. Der Hausherr Madruscht lässt auf sie schießen und befiehlt, die Überlebenden zur Folter zu schleppen.

Dritter Akt: Rom im Hause Palestrinas
Palestrina sitzt im Schein der untergehenden Abendsonne zu Hause in seinem Lehnstuhl. Der Komponist macht einen deutlich mitgenommenen und noch weiter gealterten Eindruck, denn er war zwischen-zeitlich verhaftet und eingekerkert worden. Erst nachdem sein Sohn Ighino den Kirchenschergen die Partitur seines neuen Werkes ausgeliefert hatte, war er wieder freigekommen. Jetzt warten beide zusammen mit einigen Sängern aus Palestrinas Chor auf den Erfolg der soeben aufgeführten Messe. Der Komponist wirkt dabei im Gegensatz zu den anderen agierenden Personen völlig geistesabwesend, die zurückliegenden und gegenwärtigen Vorgänge sind ihm kaum bewusst. Plötzlich erschallen auf der Straße immer näher kommende Hochrufe: „Evviva Palestrina!“ Sänger der päpstlichen Kapelle drängen ins Haus und verkünden den großen Erfolg von Palestrinas neuer Komposition. Auf dem Höhepunkt der allgemeinen Begeisterung erscheint der Papst, um Palestrina persönlich zu gratulieren und ihm zum lebenslangen Leiter der Kirchenmusik in der Sixtina und zum „Fürsten der Musik“ zu ernennen. Nachdem sich Pius IV. zusammen mit der jubelnden Menge wieder entfernt hat, tritt der Kardinal Borromeo auf Palestrina zu. Er fällt dem Musiker zu Füßen, bittet ihn um Verzeihung und reißt sich endlich mit abgewandtem Gesicht aus seinen Armen. Ighino bleibt mit Palestrina alleine zurück. Vor Freude überwältigt wundert er sich, dass sein Vater selbst so wenig Euphorie zeigt. Schließlich läuft er auf die Straße, um seiner jugendlichen Begeisterung Ausdruck verleihen zu können, während sich Palestrina, nachdem er eine Weile Gedanken versunken vor dem Bild seiner Frau gestanden hat, in der Improvisation einiger Töne auf seiner kleinen Hausorgel verliert. Mit einem kaum noch hörbaren Orgelpianissimo klingt die Oper aus.