Die Uraufführung fand am 21. Januar 1904 in Brünn statt. Veränderte Fassungen wurden 1906, 1911 und 1913 aufgeführt, bevor am 26. Mai 1916 in Prag mit einer durch Karel Kovařovic modifizierten Version die erste auf breiter Front wahrgenommene Aufführung erfolgte. 1908 erhielt die Oper die Widmung Im Andenken an Olga Janáčková. In Berlin dirigierte in den 20er Jahren Erich Kleiber die deutsche Erstaufführung. Neben den genannten Versionen existiert auch eine "Brünner Fassung" von 1908, die als Partitur veröffentlicht, allerdings erst 1996 in Wien uraufgeführt wurde. Von Max Brod gibt es eine Übersetzung des Librettos ins Deutsche.
 
Erster Akt (Sommer)
Jenufa ist unehelich schwanger von Stewa. Die beiden möchten heiraten, um die "Schande" eines unehelichen Kindes abzuwenden, doch die Umsetzung dieser Absicht hängt davon ab, ob Stewa zum Militär muss oder nicht. Jenufas diesbezügliche Ängste stellen sich jedoch als unbegründet heraus, als Stewa von der Musterung zurückkehrt
Dennoch kann die Hochzeit nicht bald stattfinden, denn Jenufas Stiefmutter, die Küsterin, welche von der Schwangerschaft nichts weiß, erlegt dem Paar ein Jahr der Prüfung auf. Stewas Halbbruder Laca, der Jenufa ebenfalls liebt, verletzt Jenufa aus Eifersucht mit einem Messer im Gesicht, wenngleich er seine Tat unmittelbar darauf bereut

Zweiter Akt (Winter)
Um die Schwangerschaft geheim zu halten (und Jenufa damit die "Schande" zu ersparen), wird Jenufa von ihrer Stiefmutter versteckt gehalten, während die Dorfgemeinschaft sie in Wien wähnt. Auch die Entbindung findet heimlich bei der Stiefmutter statt. Doch Stewa, dessen Interesse an der durch die Messerattacke entstellten Jenufa geschwunden ist, nimmt nicht einmal die Geburt seines eigenen Kindes zum Anlass, sich um Jenufa zu kümmern. Auch Versuche der Stiefmutter, seine Liebe wieder zu entflammen, scheitern. Die Küsterin versucht daraufhin, eine Verbindung zwischen Laca und Jenufa herbeizuführen, da er diese immer noch liebt. Doch zwischen ihm und Jenufa steht das Kind – in den Wertvorstellungen der Dorfbewohner wiegt die Schande des unehelichen Kindes zu schwer. In dieser Situation lässt sich die Küsterin Laca gegenüber zu der Lüge hinreißen, das Kind sei gestorben.

Doch damit nimmt das Verhängnis seinen Lauf: Um die Ehe zwischen Laca und Jenufa zu ermöglichen, betäubt die Küsterin Jenufa und ertränkt das Kind; anschließend behauptet sie gegenüber Jenufa, diese habe zwei Tage im Fieber gelegen und das Kind sei in dieser Zeit gestorben. Jenufa geht auf Lacas Werben ein, die Hochzeit wird beschlossen.

Dritter Akt (Frühjahr)
Es ist der Morgen der Hochzeit, die Gäste trudeln ein. Doch es entsteht ein Aufruhr, als Dorfbewohner die Leiche eines Kindes unter tauendem Eis finden. Anhand der Kleidung erkennt Jenufa das tote Baby als das ihrige. Alle vermuten in ihr die Mörderin und sind kurz davor, sie zu steinigen, als die Küsterin ihre Schuld eingesteht. Jenufa erkennt, dass nicht Böswilligkeit, sondern die Liebe zu ihr Grund für den Kindsmord waren und verzeiht ihrer Stiefmutter. Laca steht trotz allem zu Jenufa; gemeinsam versuchen sie einen neuen Anfang in der Fremde.