Vorgeschichte
Kaiser Rudolf II. (1552–1612) gibt einige Jahre vor seinem Tod bei seinem Leibarzt Hieronymos Makropulos ein Getränk in Auftrag, das das Leben um 300 Jahre verlängern soll. Makropulos soll das Mittel an seiner Tochter Elina ausprobieren. Elina fällt jedoch ins Koma, und der Leibarzt kommt ins Gefängnis.
Elina stirbt aber nicht, sondern wird wieder gesund, lebt seitdem ohne zu altern unter wechselnden Namen, aber immer den gleichen Initialen: E. M.
Erster Akt
Anwaltskanzlei Kolenatý. Der seit fast hundert Jahren schwelende Erbschaftsstreit zwischen den Familien Prus und Gregor wird wieder vor Gericht verhandelt. In der Anwaltskanzlei fragt Albert Gregor nach dem Verlauf des Prozesses. Sein Anwalt tritt in Begleitung der Opernsängerin Emilia Marty ein, die Interesse an dem Prozess hat und auch Details beisteuern kann, die bislang unbekannt waren. Sie bezeichnet Gregor als Nach-fahren des damals verstorbenen Barons Prus und der Sängerin Ellian MacGregor und gibt genaue Hinweise zum Verbleib des Testaments. Der Anwalt wird beauftragt, den Hinwei-sen nachzugehen. In der Zwischenzeit nähert sich Gregor der Frau, wird aber zurückge-wiesen. Stattdessen fragt Emilia Marty ihn nach einer bestimmten griechischen Hand-schrift.
Der Anwalt kehrt mit dem gefundenen Testament und weiteren Papieren in Begleitung des Prozessgegners Jaroslav Prus zurück, der die Unterlagen jedoch erst herausgeben will, wenn bewiesen ist, dass Gregor der Erbe ist.
Zweiter Akt
Bühne des Theaters nach der Vorstellung. Eine Putzfrau und ein Bühnenarbeiter plaudern über das Privatleben der Marty. Die junge Sängerin Krista glaubt vor der Entscheidung zu stehen, sich zwischen Janek Prus und der Kunst entscheiden zu müssen. Emilia Marty weist die Geschenke und Komplimente ihrer Verehrer zurück, beleidigt Janek und Krista. Ein alter Mann, Hauk-Schendorf, glaubt in Marty eine Sängerin wiederzuerkennen, Eugenia Montez, mit der er vor fünfzig Jahren ein Verhältnis hatte. Emilia gibt sich ihm durch Zärtlichkeiten zu erkennen, schickt dann alle bis auf Jaroslav Prus weg.
Dieser hat bei Prüfung der Unterlagen Liebesbriefe gefunden, die mit E. M. unterzeichnet sind. Er glaubt, dass nicht Ellian McGregor vor hundert Jahren die Mutter des in Frage stehenden Erben gewesen sei, sondern Elina Makropulos, wodurch der Besitz Gregor wiederum nicht zustehe, sondern allenfalls der Familie Makropulos.
Emilia Marty bringt Janek Prus dazu, den Diebstahl der Dokumente zu versuchen, was ihm aber nicht gelingt, da sein Vater das Gespräch belauscht hat. Emilia bietet diesem darauf-hin eine gemeinsame Nacht an, für die sie die Dokumente haben will. Jaroslav Prus akzep-tiert.
Dritter Akt
Ein Hotelzimmer am nächsten Morgen. Prus übergibt der Sängerin die griechische Hand-schrift. Die Nachricht trifft ein, dass sein Sohn sich selbst getötet hat. Hauk-Schendorf kommt, um Emilia Marty als seine frühere Geliebte nach Spanien mitzunehmen.
Prus, Gregor, der Anwalt und sein Kanzleivorsteher treten auf und nehmen Emilia Marty ins Verhör. Sie gibt dabei sowohl ihre Identitäten preis, als auch die Bedeutung der Handschrift, die es ihr ermöglichen würde, weitere 300 Jahre zu leben. Doch nun, da ihr der Weg offen steht, will sie nicht mehr. Sie gibt die Handschrift an Krista weiter, die sie verbrennt. Elina Makropulos bricht zusammen.